и.М. Сеченова рАН, Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44, 194223, Санкт-Петербург, россия; e-mail: bazhanovae@mail.ru; ‘‘Graduate School of Biomedical Sciences-Stratford Division, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Stratford, New Jersey, USA; ²Нии онкологии им. проф. Н.Н. Петрова росмедтехнологий, ул. Ленинградская, 68, Песочный-2, 197758 Санкт-Петербург; e-mail: aging@mail.ru

Тирозинкиназный рецептор HER2/neu играет важную роль во многих процессах, в том числе в канцерогене­зе. Онкогенные характеристики HER2/neu связаны с влиянием на различные апоптотические пути в клетках, сверхэкспрессирующих этот белок. Целью работы было изучить изменения в регуляции процесса апоптоза, вы­зываемые сверхэкспрессией HER2/neu , в нейросекре-торных клетках (НСК) гипоталамуса HER2/neu трансген­ных мышей при старении. Мы исследовали экспрессию апоптотических сигнальных белков (Вах, с-Raf) в срав­нении с уровнем апоптоза и функциональной активнос­тью (уровень вазопрессина) в нейроэндокринной сис­теме. Кроме того, определяли уровень 17р-эстрадиола в плазме крови как одного из возможных антиапопто-тических факторов, активных в нейронах. Показано, что при старении у данных мышей не наблюдается ак­тивации апоптоза НСК, в отличие от животных дикого типа. Ранее мы выявили, что основным механизмом подавления апоптоза у трансгенных мышей является блокирование р53-зависимого каскада, что приводит к снижению синтеза caspase-8, дисрегуляции синтеза антиапоптотических белков Bcl-2 и Mcl-1. В настоящей работе обнаружено снижение синтеза Вах и отсутствие изменений экспрессии c-Raf-1. Важным фактором, принимающим участие в повышении выживания клеток гипоталамуса трансгенных животных, является 17| -эс-традиол, уровень которого в плазме крови не снижается при старении. Кроме того, у HER2 мышей, независимо от возраста, интенсифицируется синтез вазопрессина. Результатом всего этого является повышенное выжива­ние НСК старых трансгенных мышей.

Ключевые слова: апоптоз, старение, HER2/neu трансгенные мыши, нейросекреторные клетки, Вах, ва-зопрессин, эстрадиол, с-Raf-l.

Введение

Онкопротеин ErbB2 (HER2/new), как известно, является членом ErbB семейства трансмембранных тирозинкиназных рецепторов. Эти рецепторы, кроме ErbB2, обладают возможностью связывать большое число лигандов с характерными признаками эпидер-мального фактора роста. В настоящее время не обнару­жено высокоспецифичного лиганда для HER2, однако он и без лиганда обладает сильным тирозинкиназным доменом. Поэтому этот белок может формировать, кроме гетеродимеров, и активные гомодимеры. Однако гетеродимеризация повышает эффективность и разно­образие проведения сигналов [15].

Димеризация рецепторов активирует домен ци-топлазматической тирозинкиназы, приводя к фосфо­рилированию специфических тирозиновых остатков в цитоплазматических хвостах рецепторов. Эти фосфо-рилированные тирозины являются сайтами узнавания для ряда внутриклеточных белков, опосредующих акти­вацию проведения сигналов [19]. Показано, что ErbB2 действует как важная субъединица ErbB рецепторного димера, это может повышать сродство лигандов к ErbB рецепторам и усиливать и пролонгировать сигнальные пути трансдукции [12].

Как известно, гетеродимеризация ErbB2/ErbB1 приводит к активации PI3K пути, что способствует выживанию клетки [17]. PI3K через активацию серин-треониновой киназы Akt блокирует TNF-зависимые [26] и р53-зависимые [18] апоптотические пути. По данным литературы, HER2/ErbB2, предупреждая р53-зависимый апоптоз, не влияет на синтез белков се­мейства Bcl-2 [18]. Наши предыдущие исследования, однако, показали, что снижение экспрессии р53 соче­тается со значительным изменением синтеза Мс1-1 и Bcl-2 в нейросекреторных клетках (НСК) HER2/neu трансгенных мышей [1].

Известен другой путь, при котором HER2/ErbB2 активирует MAPK-каскад, ответственный за регуля­цию клеточного цикла [11, 12]. Показано, что ErbB2 повышает активность нескольких семейств транскрип­ционных факторов, таких как Ets, AP-1 и NF- B, и что активация этих мишеней опосредована Ras-сигнальным путем [6], который является важным звеном в MAPK-сигнальном каскаде и участвует в регуляции апоптоза.

Механизмы функционирования HER2 рецепторов в последнее время активно изучаются благодаря роли этих молекул в развитии рака [15, 24]. Ясно, что он­когенные характеристики HER2/neu связаны с воз­можностью влиять на различные апоптотические пути и, таким образом, на антиапоптотическое окружение в клетках, сверхэкспрессирующих этот белок. Роль HER2 будет также зависеть от типа самой клетки, так как метаболизм раковых и нормально функционирую­щих клеток значительно различается. Однако до сих пор недостаточно изучено участие HER2 в регуляции апоптоза нормальных клеток. В данной работе мы продолжаем рассматривать изменения, вызываемые сверхэкспрессией HER2/neu, в НСК супраоптическо­

31

Е.Д. Бажанова и др.

го (СОЯ) и паравентрикулярного (ПВЯ) ядер гипота­ламуса. Целью исследования было изучение экспрессии Вах и с-Raf, как апоптотических сигнальных белков, в сравнении с уровнем апоптоза и функциональной ак­тивностью (уровень вазопрессина) в нейроэндокрин-ной системе (НЭС) старых HER2/neu трансгенных мышей. Кроме того, мы определяли уровень 17|3-эстра-диола в плазме крови, как одного из возможных антиа-поптотических факторов, активных в нейронах [4, 13].

Материалы и методы

использованы мыши самцы: HER2/neu трансген­ные молодые (2 мес, n=4) и старые (11 мес; n=4) (жи­вотные получены из Нии онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург) и контрольная группа (SHR) 2- и 18-месячных животных, по 4 в каждой группе. Все животные декапитированы в один день. HER2/neu трансгенные мыши являются ускоренно стареющи­ми [20], продолжительность их жизни составляет около 12 мес вследствие функциональных поврежде­ний органов и тканей и повышенного канцерогенеза. Гипоталамическую область мозга, содержащую СоЯ и ПВЯ, фиксировали в 4% формалине и после рутин­ной проводки заливали в парафин.

Уровень апоптоза. Клетки с конденсированным хроматином и высокой интенсивностью свечения (апоптотические клетки) в СоЯ и ПВЯ выявляли с помощью люминесцентного микроскопа PFM (WPI) (длина волны 546 нм) на срезах, окрашенных этидием бромидом (0,05 мг/мл) с помощью цветной цифро­вой камеры DIC-E (WPI) и компьютерной программы Matrox Inspector. Для определения процентного соот­ношения апоптозных клеток в изучаемых ядрах дела­лись микрофотографии СоЯ и ПВЯ с 4-5 срезов ги­поталамуса каждого животного, на которых визуально подсчитывалось общее число НСК в ядре, и отдельно число клеток, подвергшихся апоптозу. Затем опреде­лялась доля апоптозных клеток в каждом из нейро-секреторных центров на одно животное и, далее, на группу. Анализ изображения производили с помощью

16 -л

о

14 -

к . _ ________

Рис. 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35