3.2.1. Устойчивость

Устойчивость определяли с использованием следующего экспериментального проектирования. Оценивали четыре хроматографических параметра, контролирующих разде­ление: количество ацетонитрила в подвижной фазе (Ас), концентрация буфера в подвижной фазе (В^, скорость потока (Fl) и температура колонки (Те). Установка и расчеты были сделаны при помощи программного обес­печения Moddle 4.0 (Umetrics, Umea, Sweden). Значения, которые использовались на центральном (0), высоком (+1) и низком уровне (-1), показаны в Табл. 2. Типичная хроматограмма контрольного образца, полученная при центральном значении условий, показана на Рис. 2(А). Поскольку наиболее критичное разделение происходит между пиками 2 и 3, селективность между этими двумя пиками была выбрана в качестве переменной отклика. Разработка требовала 2^k + 2k + n = 27 измерений, где к - количество исследуемых параметров (k = 4) и n - количество включенных централь­ных точек (n = 3). Множественная линейная регрессия использовалась для оценки коэффициентов моде­ли, представляющей взаимосвязь между измеряемой переменной отклика и исследуемыми хроматог-рафическими параметрами. Целые коэффициенты описывают коли­чественный эффект переменной на отклик, комбинационные состав­ляющие взаимодействий между переменными и квадратными коэф­фициентами нелинейных эффектов.

Результаты показаны на Рис. 3. Диаграмма состоит из прямоугольни­ков, которые соответствуют регресси­онным коэффициентам с амплитудой эффектов, пропорциональной регрес­сионным коэффициентам. 95% дове­рительные интервалы изображены с

Табл. 2. Хроматографические параметры и диапазон исследования для факторов экспериментального проектирования

использованием планок погрешностей. Регрессионный коэффициент, меньший чем интервал планки погрешнос­ти, указывает, что отклонение в отклике получается из­менением того хроматографического параметра, который меньше, чем экспериментальная ошибка. Таким образом, эффект этой переменной считается незначительным.

Результаты показывают, что на разделение в рассмат­риваемых условиях принципиально влияет количество ацетонитрила в подвижной фазе и температура колонки. Оба этих показателя обладают отрицательным эффектом на селективность, которая означает, что увеличение про­центного количества ацетонитрила в подвижной фазе или увеличение температуры колонки, понизит селективность между пиками 2 и 3. Влияние скорости потока подвижной фазы и концентрации буфера незначительно. Не было найдено никакой значительной взаимосвязи. Лучшая оценка эффекта наиболее важных параметров может быть проведена посредством объемного графического изображения отклика. Селективность для пиков 2 и 3 варьируется как функция количества ацетонитрила в под­вижной фазе и температуры колонки показана на Рис. 4.

Статистический анализ модели давал величину R2 (фрагмент изменения отклика, который может объяс­няться моделью) равную 0,98 и значение Q2 (фрагмент изменения отклика, который может быть предсказан моделью) равное 0,93.

3.2.2. Количественные аспекты

Для теста на чистоту инжектировали 10 мкл раствора с концентрацией 0,5 мг/мл, тогда как для количествен­ного определения использовали раствор 0,1 мг/мл. Воспроизводимость метода определяли шестикрат-

I. hi Jri ‘ly^ pi> ".км 2 unknown

Л. d"pi‘.l"LJIvl

4. R-enantiomer

Рис. 1. Химическая структура клопидогрел и продукта его гидролиза

Рис. 2. Совмещение хроматограмм некоторых образцов в сравнении с контролем: (А) контрольный продукт, (В) продукт 3, (С) продукт 13 и (D) продукт 5. Хроматографические условия упоминались в разделе 2.4.

Журнал НИИ кардиологии и внутренних болезней МЗ РК

399

ным анализом раствора с концентрацией 0,1 мг/мл. Относительное стандартное отклонение (R.S.D.) от­носительной площади основного пика было 0,7%. Значение предела детектирования (LOD) определяли при соотношении сигнал/шум равном 3 (S/N = 3) и зна­чение предела количественного определения (LOQ) при соотношении сигнал/шум равном 10 (S/N = 10). Для продуктов гидролиза значения LOD-LOQ были равны 0,5 и 0,15 нг и для R-энантиомера 1,5 и 4,9 нг соответственно. Это означает, что LOQ всегда ниже 0,1%. Результаты линейности клопидогреля, продукта его гидролиза и R-энантиомера показаны в Табл. 3.

3.3. Тест на чистоту

Значения, полученные в точке времени ноль и после 3 месяцев хранения при экстремальных условиях (40⁰С и относительная влажность 75%), показаны в Табл

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69