ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ МАГНИТНОГО ПОЛЯ ЗЕМЛИ НА СУТОЧНУЮ ДИНАМИКУ ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ СЛЮНЫ ЧЕЛОВЕКА НА СЕВЕРЕ
представляют сравнительно простые модельные системы, с помощью которых можно успешно разрабатывать многие проблемы морфологии и физиологии. Используемый для идентификации и характеристики биологически активных веществ метод тканевых культур относительно прост и сравнительно недорог, что дает возможность обойтись без продолжительных и дорогостоящих исследований на интактных животных. Для тестирования биологической активности различных препаратов успешно используется органотипическая культура ткани [5-7, 9]. Она является адекватной моделью для исследования действия биологически активных веществ на ткани потому, что в ней сохраняются «иерархические» соотношения различных клеточных популяций. Этот метод обладает также преимуществами, связанными с отсутствием в культуре ткани нервных, гуморальных и других влияний, которые присутствуют в целостном организме. Применение органотипических культур позволяет поместить исследуемый объект в стандартные контролируемые условия, что дает возможность строго дозировать испытуемые вещества. Причем используемые в нем наномолярные концентрации изучаемых соединений позволяют вплотную подойти к исследованию молекулярных механизмов клеточных реакций.
В настоящей статье представлены данные о влиянии пептидных биорегуляторов эпифиза эпиталона и эпита-ламина на клеточный рост при культивировании фрагментов медиальной преоптической области (МПО) гипоталамуса крыс. МПО является гипоталамической структурой, в которой синтезируется гонадолиберин или лютеинизирующий гормон-релизинг фактор (LH-RH), стимулирующий выработку гипофизом гонадотропинов, регулирующих функциональную активность половых желез. В последние годы пристальное внимание уделяется изучению воздействия эпифизарного гормона ме-латонина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции [1, 2, 8]. В этой связи интерес представляет исследование участия в процессе пептидов эпифиза, способных оказывать влияние на уровень содержания и секрецию мелатонина [3, 4].
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на 800 эксплантатах МПО гипоталамуса 3-месячных (молодых) и 24-месячных (старых) самок крыс линии Вистар. Отпрепарированные ткани разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), ген-тамицин (100ед./мл). Исследуемые препараты - эпи-таламин и эпиталон - добавлялись в культуральную среду в концентрациях 0,05-200 нг/мл.
В чашки Петри с экспериментальными экспланта-татами добавляли 3 мл питательной среды с исследуемой концентрацией пептида, а в чашки Петри с контрольными эксплантатами - 3 мл питательной среды, таким образом, эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помеща-
61
Ю.П. Милютина и др.
ft |
|
|
-I- |
|
1 |
|
|
|
Рис. 1. Влияние эпиталамина (1), эпиталона (2), ливагена (3), простамакса (4), вилона (5) на развитие
в культуре МПО молодых и старых крыс. По оси ординат - индекс площади (ИП) эксплантатов;
* p<0,05.
ли в термостат при температуре 37 оС и через 3 суток просматривали под фазово-контрастным микроскопом. Определялся индекс площади (ИП), который рассчитывался в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Для каждого исследуемого вещества анализировали 20-25 экспериментальных и 20-23 контрольных эксплантатов.
При иммуногистохимическом исследовании эксплантатов в периферической зоне роста на третьи сутки определяли экспрессию проапоптозного белка р53NA. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку р53 (1:75, Novocastra) и к фактору пролиферации PCNA (1:200, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилирован-ные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной перокси-дазой (ABC-kit) с последующим проявлением перок-сидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Для визуализации экспрессии р53 и PCNA использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом. Морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ EXСEL и STATISTICA 5.0 (Statsoft). Для оценки межгрупповых различий (сравнения средних контрольных и экспериментальных значений) применяли t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования
На первые сутки культивирования эксплантаты распластывались на коллагеновой подложке и начиналось выселение клеток по периферии, составляющей зону роста от края эксплантата. В развитии зоны роста культивируемых в органотипической культуре фрагментов тканей, как известно, участвуют пролиферационные и миграционные механизмы, имеют значение также адгезивные способности различных типов клеток. В данной работе учитывался суммарный эффект этих процессов, выражающийся в размерах развивающейся зоны роста эксплантатов. Через трое суток, если в эксперименте происходила стимуляция развития зоны роста, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. В случаях замедления развития зоны роста ИП эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями ИП.
При культивировании фрагментов МПО 3-месячных крыс выявлено, что зона роста эксплантатов состояла из мигрирующих нейронов с крупными центрально расположенными ядрами, а также глиальных клеток и фибробластоподобных элементов. У молодых животных выраженная стимуляция развития эксплантатов происходила под влиянием эффективных концентраций эпиталамина (100 нг/мл), когда ИП увеличивался на 35±7% (n=24, p<0,05) по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n=23). Стимуляция развития эксплантатов МПО происходила также под влиянием эффективных концентраций эпиталона (2 нг/мл): ИП возрастал на 25±3% (n=21, p<0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n=22).
При культивировании фрагментов МПО 24-месячных крыс также наблюдалась стимуляция развития эксплантатов: под влиянием эпиталамина ИП возрастал на 23±4% (n=25, p<0,05) по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n=21), а в присутствии эпи-талона - на 20±1% (n=20, p<0,05) по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n=23). Синтетические тетрапептиды ливаген, простамакс и вилон, используемые как препараты сравнения, влияния на развитие эксплантатов МПО молодых и старых крыс не оказывали, и ИП оставался на уровне контрольных значений
(рис. 1).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что как комплексный полипептид эпита-ламин, так и синтетический пептид эпиталон обладают выраженной тканеспецифичностью по отношению к культивируемой МПО как у молодых, так и у старых животных. При этом интересно отметить, что действие пептидных препаратов эпифиза, особенно эпиталамина, проявляется более выражено у молодых крыс. У старых животных стимулирующее влияние эпиталамина и эпиталона на рост ИП эксплантатов ослабевает, причем оба препарата оказывают примерно одинаковый эффект на этот процесс. Можно предположить, что это связано
62
УСПЕХИ ГЕРОНТОЛОГИИ • 2007 • Т. 20, № 4
% 40
Рис. 2. Влияние эпиталона на ИП (1) и площадь экспрессии р53 (2) в культуре МПО;
* p<0,05
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43