20, № 4

© Коллектив авторов, 2007 г. УДК 613.648-053:599.323.4

Успехи геронтол.-2007-Т. 20, № 4.-С. 64-67

С.Д. Иванов^[3], М.П. Собуцкий^[4], Е.Г. Кованько^[5], С.И. Лютинский^[6], А.М. Беркович^[7]

эффекты лигфола при радиационно-ртутном воздействии на крыс разных возрастных групп

Работа была проведена на молодых (4-5 мес) и по­жилых (15-18 мес) крысах обоего пола. Животные по­лучали с питьевой водой соль ртути в концентрации 1 мкг/л в течение 3 месяцев до и 1 месяца после од­нократного рентгеновского облучения в дозе 25 сГр. Генотоксические эффекты в лейкоцитах оценивали на основании изменений содержания и структуры ДНК че­рез 24 ч и через 1 мес после облучения. В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансфе-разы. Результаты внутримышечного введения Лигфола в дозе 250 мг/кг за 24 ч до облучения наблюдались в период от 24 ч до 2 мес после рентгеновского воздейс­твия; наиболее чувствительными к низким дозам ради-ационно-ртутных воздействий и к исследуемому препа­рату оказались молодые крысы обоего пола и пожилые самки.

Ключевые слова: молодые и пожилые крысы, радиа-ционно-ртутное воздействие в малых дозах, генотокси­ческие эффекты, АЛТ сыворотки крови, Лигфол.

Введение

Лигфол (коммерческое название фармацевтичес­кого препарата олипифат) представляет собой про­изводное лигнина, обладающее выраженными анти-оксидантными и антирадикальными свойствами [1]. Исследование радиобиологических свойств Лигфола при среднелетальных и нелетальных у-воздействиях выявило его гемостимулирующие свойства при легкой степени лучевого поражения организмов млекопита­ющих [3]. Было предположено, что в связи с отсутс­твием выраженной токсичности препарат может быть использован при сочетанных радиационно-химических воздействиях в малых дозах в экологически неблаго­приятных регионах, загрязненных, например, радиоак­тивным цезием в результате Чернобыльской аварии и т.п. Задачей настоящей работы явилось изучение воз­можности профилактического применения препарата Лигфол при комбинированном действии на экспери­ментальных животных различного возраста и пола соли ртути в допустимых концентрациях в сочетании с малы­ми дозами радиации, так как известно, что после таких радиационно-химических поражений могут обнаружи­ваться генотоксические эффекты в лейкоцитах, повреж­дения органов-мишеней и сокращение продолжитель­ности жизни организмов млекопитающих [2, 4].

Материалы и методы исследования

Эксперимент производился на 195 нелинейных крысах (разводки питомника ЦНИРРИ Росздрава). В работе исследовались самцы и самки крыс молодо­го (4-5 мес) и пожилого (15-18 мес) возраста в на­чале эксперимента. В качестве модели химического токсиканта животные получали соль ртути Hg₂(NO₃)₂ («ЧДА», «Реахим», РФ) с питьевой водой в максималь­но допустимой концентрации - 1 мкг/л в расчете на металл. Это соединение крысам вводили в течение 3 мес до и 1 мес после общего равномерного однократ­ного облучения рентгеновскими лучами в дозе 0,25 Гр на аппарате РУМ-17 (напряжение 200 кВ, ток 15 мА, фильтр - 2 мм Cu+1 мм Al; мощность поглощенной дозы 0,16 Гр/мин). Препарат Лигфол (производства ООО «Лигфарм», Россия) вводили внутримышечно в дозе 250 мг/кг за 24 ч до облучения. Пробы крови получали прижизненно из хвостовой вены животных дважды: через 24 ч после рентгеновского облучения (для оценки ранних реакций животных) и через 1 мес после облучения (для определения степени восста­новления после радиационно-химического воздейс­твия).

Такие параметры, как общее количество лейкоци­тов и их отдельных фракций были исследованы с по­мощью рутинных гематологических методов.

Оценка генотоксических эффектов в лейкоцитах осуществлялась в серийных экспериментах в ходе ра­боты путем определения изменений содержания ин­декса ДНК (ИД) лейкоцитов (пг/кл) и структуры ДНК (с помощью коэффициента относительной флуоресцен­ции КОФ, отражающего степень суперспирализации полинуклеотида) белых клеток крови с использовани­ем флуоресцентных красителей, как описано ранее [2]. Вкратце, ИД лейкоцитов определяли как отношение концентрации ДНК (мкг/мл) к количеству лейкоцитов в 1 мл крови. Для измерения концентрации полинук-леотида использовали ДНК-специфический флуо­ресцентный краситель 4‘6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ) («Serva», Германия) в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. В качестве стандарта использовали сони­

64

УСПЕХИ ГЕРОНТОЛОГИИ • 2007 • Т. 20, № 4

цированную ДНК тимуса теленка («Serva», Германия). Значение ИД лейкоцитов периферической крови ин-тактных крыс принимали соответствующим диплоид­ному (2с) содержанию ДНК белых клеток крови. Если значение ИД было меньше 2с, то считали, что число клеток, имеющих количество ДНК меньше диплоид­ного, было увеличено за счет апоптозной гибели ДНК содержащих клеток крови. Увеличение величины ИД было обусловлено повышением количества клеток с анеуплоидным и тетраплоидным содержанием ДНК. Изменения величин ИД были верифицированы пу­тем параллельного анализа отдельных проб с помо­щью проточной цитометрии [2]. Для характеристики структуры ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови крыс применяли двухпараметровый флуоресцентный ана­лиз суперспиральной структуры ДНК нуклеоидов, включающий использование интеркалятора - этидий бромида («Sigma», США) и неинтеркалирующего ДНК-лиганда - ДАФИ. Этот двухпараметровый показатель вычисляли в виде КОФ, представляющего отношение флуоресценции нуклеоида, окрашенного этидий бро­мидом с конечной концентрацией 4 мкг/мл, к вели­чине флуоресценции ДАФИ-окрашенного нуклеоида. Измерения флуоресценции проводили на флуорес­центном спектрофотометре «Model-850» («Hitachi», Япония).

Кроме того, через 2 мес после облучения в сыво­ротке крови крыс на биохимическом анализаторе-фотометре «Stat fax 1904 Plus» фирмы «Awareness Technology** США определяли активность фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) для оценки функ­ционального состояния печени - органа-мишени ртутных воздействий. Повышение энзиматической активности является, как известно, отражением пов­реждения клеток печени.

Результаты исследования

После введения Лигфола без облучения у молодых самцов крыс через 24 ч наблюдалось примерно 60% увеличение числа сегментоядерных гранулоцитов, при этом показатели ДНК не отличались от величин интак­тного контроля; через 1 мес после введения препарата число лейкоцитов нормализовалось, однако величина ИД на 30% превышала контрольный уровень.

В ранние сроки после облучения молодых самцов, получавших соль ртути с питьевой водой, не наблюда­лось изменения количества лейкоцитов, а при введении таким крысам Лигфола наблюдалось 18% повышение количества лейкоцитов по сравнению с крысами, под­вергшимися сочетанному воздействию (табл. 1). Через 1 мес это различие увеличивалось до 60%, и было обус­ловлено всеми основными фракциями белых клеток крови. У крыс, не получивших Лигфол, общее коли­чество лейкоцитов через месяц осталось без изменений относительно контроля, но вместе с тем наблюдалось 27% снижение количества гранулоцитов(р<0,05). При введении Лигфола у крыс после сочетанных воздейс­твий как через 24 ч, так и через 1 мес не наблюдалось отклонений величины ИД от уровня этого показателя в группе интактного контроля, в то время как без вве­дения препарата через 1 мес после радиационно-ртут-ных воздействий наблюдалась тенденция возрастания величины ИД по сравнению с интактным контролем. Изменений показателя структуры ДНК во всех груп­пах подопытных молодых самцов по сравнению с пока­зателями в группе интактного контроля ни через 24 ч, ни через 1 мес выявлено не было. Уровень активности АЛТ в результате радиационно-ртутных воздействий возрастал более чем на 60% (табл. 2), а при введении Лигфола наблюдался значимый нормализующий эф­фект (активность АЛТ достоверно снижалась и оста­валась повышенной лишь на 14%).

Пожилые самцы оказались более устойчивыми к воздействию на организм как комбинированного низ-кодозового поражения, так и к введению исследуемого препарата

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43